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細胞周期檢測
來源：萬物生物 發(fā)布時間：2021-11-02
細胞周期
細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數(shù)法等。
一、BrdU法
1、原理
BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復制的原料，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。
細胞周期（Tc）=48/{（M1 2M2 3M3 4M4 ）/100}（小時）
2、儀器、用品與試劑
2.1、儀器、用品：同常規(guī)細胞培養(yǎng)
2.2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液
3、操作步驟
3.1、細胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使最終濃度為10μg/ml。
3.2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。
3.3、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。
3.4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術）。
3.5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。
3.6、棄去2×SSC液，流水沖洗。
3.7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。
3.8、鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數(shù)。
3.9、計算：
2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉·2H2 O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。
附：BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。
二、PI染色檢測細胞周期
1、離心收集細胞，棄上清，用預冷PBS洗細胞兩次。
2、加入預冷70%乙醇，于4℃固定過夜，或-20℃長期固定（4℃過夜一般隔天就進行檢測，如果想推遲幾天測，那就保存在-20℃，有資料說-20℃可以保存一個月，個人建議盡量在最短時間內(nèi)檢測，有些實驗是在不同時間點上收細胞，這時我就等最后一次固定完了一塊測，基本上也多在一周內(nèi)檢測完畢，沒有特地去比較保存時間對檢測結果的影響）。
3、細胞染色
離心收集細胞，以1mL的PBS洗細胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙錠（PI），100ug/mL RNase A， 0.2% Triton X-100， 4℃避光孵育30分鐘（PI我是直接用PBS配成工作濃度，然后加入細胞沉淀混勻，RNA酶現(xiàn)加，但有時不加發(fā)現(xiàn)對實驗結果也沒太大的影響） 。
4、流式分析
以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數(shù)2-3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。
分析時，使用FL2-w和FL2-A顯示，去除聯(lián)體細胞。
細胞周期流式后一般分為G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有個凋亡峰(也稱sub-G0期),而如果分析時細胞窗口沒設置好，可能在最前面還有細胞碎片峰。
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