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細胞系細胞株培養(yǎng)構建
來源：萬物 發(fā)布時間：2021-08-31
1.細胞系
細胞系（cell line）指原代細胞培養(yǎng)物經首次傳代成功后所繁殖的細胞群體。 也指可長期連續(xù)傳代的培養(yǎng)細胞。因此，細胞系狹義的是指可連續(xù)傳代的細胞，廣義是指可傳代的細胞。
2.細胞株
通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得具有特殊性質或標志物的培養(yǎng)物稱為細胞株（CellStrain），也就是說，細胞株是用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群。細胞株的特殊性質或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。
3.細胞培養(yǎng)
細胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術。細胞培養(yǎng)技術可以由一個細胞經過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，這是克隆技術必不可少的環(huán)節(jié)，而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。細胞培養(yǎng)技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。
4.基本過程
細胞低溫凍存是培養(yǎng)室常規(guī)工作和通用技術。細胞凍存在-196℃液氮中，儲存時間幾乎是無限的。細胞凍存及復蘇的原則是慢凍快融。
1． 凍存細胞
1）選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。
2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液，計數(shù)，使細胞密度達5×107／ml左右密度，離心，去上清。
3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點降低，使細胞內水分在凍結前透出細胞外。
4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。
5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標記。
6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內水分透出，太慢則促進冰晶形成。
操作時應戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。
2. 復蘇細胞
1）從罐中取出凍存管。
2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內完成。
3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。
4）低速離心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。
5）用培養(yǎng)液適當稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。
凍存細胞數(shù)量要充分，密度應達到107／ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×105／ml數(shù)量
3.傳代培養(yǎng)
1）吸掉或倒掉培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液。
2）向瓶內加入胰蛋白酶液和EDTA混合液少量。以能覆蓋培養(yǎng)瓶底為宜。
3）置37℃孵箱或室溫（25℃溫度）下進行消化，2~5min后把培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下進行觀察，當發(fā)現(xiàn)胞質回縮、細胞間隙增大后，應立即中止消化。
4）吸出消化液，向瓶內加入Hanks液少量，輕輕轉動培養(yǎng)瓶，把殘留消化液沖掉，然后再加培養(yǎng)液。如果僅使用胰蛋白酶消化，在吸除胰蛋白液后，可直接加入少量含血清的培養(yǎng)液，終止消化。
5）使用彎頭吸管，吸取瓶內培養(yǎng)液，按順序反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。吹打時動作要輕柔，以防用力過猛損傷細胞。
6）用計數(shù)板計數(shù)后，分別接種于新的培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。
7）細胞培養(yǎng)換液時間應根據細胞生長的狀態(tài)和實驗要求來確定。一般2～3d后應換一次生長液。待細胞鋪滿器皿底面，即可使用；也可繼續(xù)傳代擴大培養(yǎng)或換成維持液。
5.注意事項
1）防止細胞交叉污染。
2）細胞污染的預防。
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