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Western免疫印跡（Western Blot）
來源：萬物 發(fā)布時間：2021-08-31
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進行檢測。對已知表達蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。
一、 原理
與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。 該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達。
二、WB技術(shù)操作步驟：
1 樣品準備
1）分別取大約200mg組織加入液氮碾磨成粉末狀，按每200mg組織加900μl上樣Buffer(無溴酚藍)和100ul 10mg/ml PMSF，混勻，玻璃勻漿器冰點勻漿；
2）4℃，12000rpm離心10min；
3）取上清夜-70℃凍存24hr；
4）4℃ 12000rpm再次離心10min，取上清分裝，一份用于定蛋白，另一份加入溴酚藍(0.1%(W/V))后于100℃加熱4min，后于-20℃保存待用。
2 定蛋白及計算電泳上樣量
根據(jù)總蛋白測定試劑盒說明書操作測定樣本中的總蛋白含量，電泳上樣量定為40ug
3 電泳
1）安裝好電泳裝置；
2）根據(jù)不同的指標配制相應(yīng)濃度的分離膠，灌膠約3/5體積，液封(<10%用0.1%SDS,>10%用異丙醇)；
3）30min后，待凝后傾去封液；
4）配5%的濃縮膠，灌膠至距平板頂部2mm處，插入梳子, 30min后，待凝后拔出梳子，用去離子水清洗加樣孔，用濾紙吸干；
5）上樣：各樣品取50ug上樣，marker取10μl上樣(上樣前需按說明書進行預(yù)處理)；
6）緩慢加入內(nèi)、外槽緩沖液，接通電源，90v電泳至指示劑進入分離膠后，調(diào)電壓至150V繼續(xù)電泳；
7）當指示劑距平板底端1cm處時停止電泳；
4 轉(zhuǎn)膜及檢測
1）準備2個12cm的平面皿，一個裝去離子水浸泡NC膜20min，另一裝轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡海綿和濾紙20min；
2）取下膠，切除濃縮膠部分后，將分離膠浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中約5min；
3）按順序安裝好轉(zhuǎn)膜裝置（黑色板-海綿-三層濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-三層濾紙-海綿-紅色板）；
4）完全排除氣泡， 4℃，100mA轉(zhuǎn)膜2h；
5）傾去轉(zhuǎn)膜緩沖液，拆除轉(zhuǎn)膜裝置，將硝酸纖維膜放入麗春紅中搖床染色15min，用去離子水清洗至能看到條帶，后用鉛筆標出marker位置，再用去離子水震蕩以去除浮色。在右上角剪去一角以辨上下左右；
6）將膜轉(zhuǎn)移至另一容器中，用5%脫脂奶粉封閉, 4℃過夜；
7）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的一抗；
8）37℃搖床孵育約2h；
9）PBST洗滌4次，每次5min；
10）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入稀釋好的二抗，37℃搖床孵育約30min；
11）PBST洗滌4次，每次5min；
12）將膜轉(zhuǎn)移至盡可能小的容器中并加入BCIP/NBT底物，室溫孵育30min；
13）取出NC膜，用蒸餾水漂洗后晾干；
14）掃描及分析。
三、 注意事項
1、 一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定最佳條件。
2、 顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。
3、 DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細。
4、客戶要確保檢測樣本沒有問題。
5、客戶要確?？贵w的有效性。
6、實驗周期比較緊張的客戶需特別說明。
7、收費標準：以每張膜8個樣本收費，不足8個樣本的按8個樣本收費）
四、萬物生物|WB實驗周期：
接受樣本后，1-2個月。
五、萬物生物|WB實驗注意事項：
1、客戶要確保檢測樣本沒有問題。
2、客戶要確?？贵w的有效性。
3、實驗周期比較緊張的客戶需特別說明。
4、收費標準：以每張膜8個樣本收費，不足8個樣本的按8個樣本收費）
六、萬物生物|WB服務(wù)結(jié)果提供：
1、目的蛋白實驗圖片。
2、灰度分析結(jié)果。（免費分析）
3、內(nèi)參結(jié)果。（免費跑膠）
4、詳細的實驗步驟。
5、免費提供蛋白樣本保存液。
結(jié)果展示
【一站式整體科研服務(wù)，成就更高水平的科研成果】
標書基金實驗咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實驗結(jié)題指導(dǎo) 細胞分子功能驗證
實驗培訓(xùn)文章潤色 動物模型裸鼠成瘤
臨床檢測科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作
萬物生物主營業(yè)務(wù)包括實驗動物模型建立、分子生物學(xué)、載體構(gòu)建、細胞轉(zhuǎn)染、基因治療實驗、細胞功能驗證、基因敲出/入、原代培養(yǎng)、高通量測序、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)、高通量高內(nèi)涵篩選、藥效學(xué)評價、藥理毒理學(xué)實驗、慢病毒包裝與穩(wěn)轉(zhuǎn)株建立等多項科研技術(shù)服務(wù)，并建立了涵蓋實驗設(shè)計、項目實施、結(jié)果整理、數(shù)據(jù)分析及策略咨詢等一站式的科研服務(wù)體系并提供全方位科研方案。