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細(xì)胞增殖
來源：萬物生物 發(fā)布時間：2021-11-02
細(xì)胞增殖
細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖。單細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的個體。多細(xì)胞生物，以細(xì)胞分裂的方式產(chǎn)生新的細(xì)胞，用來補充體內(nèi)衰老或死亡的細(xì)胞。
多細(xì)胞生物可以由一個受精卵，經(jīng)過細(xì)胞的分裂和分化，最終發(fā)育成一個新的多細(xì)胞個體。必須強調(diào)指出，通過細(xì)胞分裂，可以將復(fù)制的遺傳物質(zhì)，平均地分配到兩個子細(xì)胞中去?？梢姡?xì)胞增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)。
一、流式熒光染色法
原理：
熒光染料CFSE， 即羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂，是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有與細(xì)胞特異性結(jié)合的琥珀酰亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團，這使得CFSE成為一種良好的細(xì)胞標(biāo)記物。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖時，具有熒光的胞質(zhì)蛋白被平均分配到第二代細(xì)胞中，這樣與第一代細(xì)胞相比，其熒光強度便會減弱至一半；以此類推，分裂得到的第三代細(xì)胞的熒光強度便會比第二代細(xì)胞再次減弱。這種現(xiàn)象可以在488nm的激發(fā)光下，采用流式細(xì)胞儀檢測分析，通過檢測到細(xì)胞熒光強度不斷的降低，進(jìn)一步分析得出細(xì)胞分裂增殖的情況。
實驗步驟，以小鼠脾細(xì)胞為例：
1.取一只6-8周小鼠頸椎脫臼處死后，將其全部浸泡于75%酒精中；
2.在超凈工作臺上無菌取出小鼠脾臟；
3.用無菌注射器內(nèi)芯研磨脾臟，盡量不殘留較大組織塊；再用3mlPBS沖洗后，將脾臟研磨液經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾至15mL離心管中，離心350g，5min；
4.棄上清后，加入2mL紅細(xì)胞裂解液，輕微吹打，裂解2min后加入等體積PBS終止裂解反應(yīng)，混勻后離心350g，5min；
5.棄上清，用RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸沉淀，并取10μL細(xì)胞液計數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)至2.0×106/ml；
6.提前將CFSE按照說明書用DMSO配成5mM母液，并分裝儲存于-80冰箱，其工作濃度為0.5-25μM；
7、取部分細(xì)胞作為不染色組陰性對照，其他細(xì)胞加入CFSE溶液，使得終濃度為5μM，37°C避光孵育15min；
8、加入1ml冰冷的RPMI1640完全培養(yǎng)液，4℃，5min以中止染色；
9、棄上清，加入冰冷的含10%FBS的完全1640培養(yǎng)液洗2次，最后用1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，充分吹打成單細(xì)胞懸液，將上述細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板,每孔105個細(xì)胞（陽性對照用PHA刺激）；
10、37℃，5%CO2培養(yǎng)3天后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞488nm激光器檢查細(xì)胞增殖情況。
結(jié)果分析：用FlowJo分析細(xì)胞增殖
在FSC/SSC 上圈出目標(biāo)細(xì)胞，使用 FSC-W/FSC-A 排除黏連體，使用 CFSE 單參看目標(biāo)細(xì)胞的增殖情況。以下圖片來源于網(wǎng)絡(luò)：細(xì)胞攝取染料后，信號最強，在最右邊（不分裂的話，就是那個桃紅色的峰），隨著細(xì)胞的每一次分裂，細(xì)胞內(nèi)染料的濃度被稀釋一倍，信號也減弱一半，以此類推，由于細(xì)胞的分裂不同步，所以最后的結(jié)果是紅色的那些齒狀的峰。
對照組：
實驗組：
實驗要點：
CFSE的濃度國外報道從0.5uM-20uM都有，建議終濃度為2.5-5uM。濃度太低，細(xì)胞標(biāo)記的熒光強度不夠，太高了對細(xì)胞有毒性，且影響細(xì)胞增殖。標(biāo)記孵育時要經(jīng)常搖勻。
二、CCK-8法
實驗原理：
CellCounting Kit-8（簡稱CCK-8）中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazan dye），生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗等。
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標(biāo)書基金實驗咨詢 表觀遺傳組學(xué)分析
課題實驗結(jié)題指導(dǎo) 細(xì)胞分子功能驗證
實驗培訓(xùn)文章潤色 動物模型裸鼠成瘤
臨床檢測科研轉(zhuǎn)化 病理染色分子互作