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小動(dòng)物活體成像
來(lái)源：萬(wàn)物生物 發(fā)布時(shí)間：2021-11-02
一、 技術(shù)原理
1. 標(biāo)記原理
哺乳動(dòng)物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素（luciferin），即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。對(duì)于細(xì)菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細(xì)菌會(huì)持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。
基因、細(xì)胞和活體動(dòng)物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞的方法基本上是通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù), 將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過(guò)單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選, 培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。目前, 常用的細(xì)胞株基本上都已標(biāo)記好, 市場(chǎng)上已有銷(xiāo)售。 將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后, 觀測(cè)前需要注射熒光素酶的底物—熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過(guò)血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)光子，這是肉眼無(wú)法觀察到的，中科愷盛公司生產(chǎn)的在體生物光學(xué)分子成像系統(tǒng)，應(yīng)用一個(gè)高度靈敏的制冷CCD相機(jī)及特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件，可觀測(cè)并記錄到這些光子。
2. 光學(xué)原理
光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類(lèi)型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到。在相同的深度情況下, 檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系?？梢?jiàn)光體內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織并且可由儀器量化檢測(cè)到的光強(qiáng)度，同時(shí)反映出細(xì)胞的數(shù)量。
3. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù), 應(yīng)用單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶蛋白的細(xì)胞株。
典型的成像過(guò)程是：小鼠經(jīng)過(guò)麻*醉系統(tǒng)被麻*醉后放入成像暗箱平臺(tái)，軟件控制平臺(tái)的升降到一個(gè)合適的視野，自動(dòng)開(kāi)啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動(dòng)關(guān)閉照明燈, 在沒(méi)有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。 與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動(dòng)物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過(guò)程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進(jìn)行測(cè)量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測(cè)量的區(qū)域后，軟件可以計(jì)算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。軟件的數(shù)據(jù)處理和保存功能非常強(qiáng)大，可以加快實(shí)驗(yàn)速度，方便大批量的實(shí)驗(yàn)。
4．熒光成像功能
熒光發(fā)光是通過(guò)激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報(bào)告基團(tuán)，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費(fèi)用低廉和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。同生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測(cè)生理指標(biāo)的最佳選擇。
雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來(lái)研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對(duì)于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法。最近許多文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)中，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行雙重標(biāo)記，用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測(cè)，進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究；然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)，進(jìn)行活體動(dòng)物體內(nèi)研究。
二、 技術(shù)應(yīng)用
通過(guò)活體動(dòng)物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可以觀測(cè)到疾病或癌癥的發(fā)展進(jìn)程以及藥物治療所產(chǎn)生的反應(yīng)，并可用于病毒學(xué)研究、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、siRNA研究、干細(xì)胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究以及細(xì)胞體外檢測(cè)等領(lǐng)域。具體應(yīng)用如下：
1. 標(biāo)記細(xì)胞
（1） 癌癥與抗癌藥物研究
直接快速地測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并可對(duì)癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估?；铙w生物發(fā)光成像能夠無(wú)創(chuàng)傷地定量檢測(cè)小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。
（2） 免疫學(xué)與干細(xì)胞研究
將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植入脾及骨髓，可用于實(shí)時(shí)觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞造血過(guò)程的早期事件及動(dòng)力學(xué)變化。有研究表明，應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞，檢測(cè)放射及化學(xué)藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)制。應(yīng)用可見(jiàn)光活體成像原理標(biāo)記細(xì)胞，建立動(dòng)物模型，可有效的針對(duì)同一組動(dòng)物進(jìn)行連續(xù)的觀察，節(jié)約動(dòng)物樣品數(shù)，同時(shí)能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉(zhuǎn)移途徑及抗性蛋白表達(dá)的改變。
（3） 細(xì)胞凋亡
當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白無(wú)熒光素酶活性，細(xì)胞不能發(fā)光，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，活化的caspase-3在特異識(shí)別位點(diǎn)切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，由此可用于觀察活體動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)事件。
2. 標(biāo)記病毒
（1）病毒侵染
以熒光素酶基因標(biāo)記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對(duì)肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵和病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)程。多種病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標(biāo)記，用于觀察病毒對(duì)機(jī)體的侵染過(guò)程。
（2）基因治療
基因治療包括在體內(nèi)將一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效的傳遞到靶細(xì)胞?？蓱?yīng)用熒光素酶基因作為報(bào)告基因用于載體的構(gòu)建，觀察目的基因是否能夠在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達(dá)。這種非侵入方式具有容易準(zhǔn)備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中, 用來(lái)觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況。
3. 標(biāo)記細(xì)菌
（1）細(xì)菌侵染研究
可以用標(biāo)記好的革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌侵染活體動(dòng)物, 觀測(cè)其在動(dòng)物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對(duì)外界因素的反應(yīng)。
（2）抗生素藥物
利用標(biāo)記好的細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)藥物的反應(yīng)，醫(yī)藥公司和研究機(jī)構(gòu)可用這種成像技術(shù)進(jìn)行藥物篩選和臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。
4. 基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用
（1）組織特異性基因表達(dá)
熒光素酶（luciferase）是一類(lèi)生物發(fā)光酶，其中的renilla熒光素酶和firefly熒光素酶分別識(shí)別不同的底物, 一種細(xì)胞可被這兩種熒光素酶標(biāo)記: renilla 熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng), 作為內(nèi)參，反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化; firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號(hào)的變化，在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動(dòng)子在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)活性。
（2）蛋白質(zhì)相互作用
觀察細(xì)胞中或活體動(dòng)物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導(dǎo)入細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強(qiáng)相互作用時(shí)，表達(dá)的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應(yīng)用此原理亦可用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
（3）阻斷RNA
通過(guò)對(duì)比生物發(fā)光的變化，驗(yàn)證在成年小鼠體內(nèi)，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達(dá)。
5. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型
（1） 基因表達(dá)
為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動(dòng)子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。利用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的研究?？捎糜谘芯縿?dòng)物發(fā)育過(guò)程中特定基因的時(shí)空表達(dá)情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá)，以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。
（2） 各種疾病模型
研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記，同時(shí)轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等?？商峁┌谢蛟隗w內(nèi)的實(shí)時(shí)表達(dá)和對(duì)候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng)，還可以用來(lái)評(píng)估候選藥物和其它化合物的毒性。為藥物在疾病中的作用機(jī)制及效用提供研究方法。
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