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免疫組化（IHC）
來(lái)源：萬(wàn)物生物 發(fā)布時(shí)間：2021-11-02
免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)
免疫組織化學(xué)是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來(lái)檢測(cè)和定位組織和細(xì)胞中蛋白或其他物質(zhì)的一門技術(shù)，它是免疫學(xué)和傳統(tǒng)組織化學(xué)相結(jié)合而形成的。免疫組織化學(xué)染色技術(shù)不僅有較高的敏感性和特異性，其特點(diǎn)是將形態(tài)學(xué)改變與功能、代謝變化結(jié)合起來(lái)，直接在組織切片，細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上定位一些蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì)的存在，并可精確到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平，結(jié)合電子計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)或激光掃描共聚集顯微術(shù)等技術(shù)，對(duì)被檢物質(zhì)進(jìn)行定量分析。
免疫組化步驟
1、切片，烤片60 ℃，1h ；
2、脫蠟及復(fù)水
二甲苯10min，二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自來(lái)水1min，雙氧水1min；
3、50mL 30％H2O2 加450mL蒸餾水，室溫10min，蒸餾水洗3次，每次3min；
4、微波修復(fù)
將切片浸入0.01M 枸櫞酸緩沖液，微波中最大火力（98℃-100℃）加熱至沸騰，冷卻（約5-10min），反復(fù)兩次；
5、將切片自然冷卻至室溫，PBS 洗滌3次，每次5min；
6、封閉，5％BSA，室溫20min，甩去多余液體；
7、滴加一抗，37℃，1h，或者4℃過(guò)夜；
8、PBS洗滌3次，每次3min；
9、滴加二抗，37℃，15-30min；
10、PBS洗滌3次，每次3min；
11、滴加SABC ，37℃，30min；
12、PBS 洗滌3次，每次5min；
13、1mL蒸餾水中分別滴加顯色劑，混勻；
14、 DAB顯色劑配置好后，滴加于切片，室溫，鏡下檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間（約5min）；
15、自來(lái)水沖洗干凈，過(guò)蒸餾水；
16、蘇木素復(fù)染2min ，自來(lái)水沖洗；
17、脫水
30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；
18、樹(shù)膠封片，鏡檢。
免疫組化常見(jiàn)問(wèn)題分析
1、石蠟切片在染色過(guò)程中出現(xiàn)脫片現(xiàn)象：
(1) 烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可以延長(zhǎng)烤片時(shí)間和提高烤片溫度；
(2) 用含有多聚賴氨酸的玻片，可以購(gòu)買到或這自己做；
(3) 有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS 不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下沖洗組織；
(4) 用高溫修復(fù)時(shí)，溫度驟冷也可能引起。
2、邊緣效應(yīng)
(1) 組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致. 解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織；
(2) 切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用組化筆畫(huà)圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫(huà)圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。
3、產(chǎn)生組織切片非特異性染色
(1) 抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過(guò)縮短一抗/ 二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這是最重要的一條；
(2) 一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；
(3) 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過(guò)延長(zhǎng)滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；
(4) 非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過(guò)延長(zhǎng)二抗來(lái)源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來(lái)加強(qiáng)封閉效果；
(5) DAB 孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或濃度過(guò)高；
(6) PBS 沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強(qiáng)著色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；
(7) 標(biāo)本染色過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。
4、免疫組化染色呈陰性結(jié)果
(1) 抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤；
(2) 抗原修復(fù)不全，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結(jié)合; 建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是最佳的時(shí)間和次數(shù)。若不行，還可高壓修復(fù)；
(3) 組織切片本身這種抗原含量低；
(4) 血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；
(5) DAB 孵育時(shí)間過(guò)短；
(6) 細(xì)胞通透不全，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng)；
(7) 開(kāi)始做免疫組化，我建議你一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片，排除抗體等外的方法問(wèn)題。
5、背景強(qiáng)
(1) 考慮一抗?jié)舛雀撸?/span>
(2) 然后調(diào)整DAB 孵育時(shí)間；
(3) 也要考慮血清封閉時(shí)間是否過(guò)短；
(4) 適當(dāng)增加抗體孵育后的浸洗次數(shù)和延長(zhǎng)浸洗時(shí)間等。
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