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BrdU 檢測試劑盒

價格：在線咨詢

貨號：

FKU0191

產(chǎn)品規(guī)格：

100 μL+30 mL×4

品牌：

萬物

購買數(shù)量：

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產(chǎn)品詳情操作說明注意事項

產(chǎn)品簡介

本產(chǎn)品BrdU檢測試劑盒，用于細胞和組織切片的細胞增殖檢測。BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine)，即5-溴脫氧尿嘧啶核苷，是胸腺嘧啶核苷(T)類似物，本試劑盒的原理在于，BrdU可以通過競爭替代胸腺嘧啶核苷T摻入DNA合成期(S期)。當處于旺盛分裂的細胞摻入BrdU后，利用抗BrdU抗體和抗體連接酶或熒光素作為指示系統(tǒng)，即可檢測出含有BrdU的細胞，結(jié)合其它細胞標記物進行雙重標記，可判斷出增殖細胞的種類、增殖速度等，對研究細胞動力學有重要意義。BrdU經(jīng)活體注射或細胞培養(yǎng)時進入組織細胞，摻入DNA定位準確，可有效反應(yīng)S期細胞新合成DNA的水平，而且受細胞內(nèi)外環(huán)境影響小，標記不會丟失。

儲存與運輸

冰袋（wet ice）運輸；破膜液、封閉液（3% BSA）、1 M HCl可4℃保存，4%多聚甲醛可常溫保存，anti-BrdU (mouse mAb)需-20℃保存，有效期12個月。

實驗準備

1. 自備PBS緩沖液、二抗、梯度乙醇、封片劑等；

2. 自備細胞核染色液；

3. 配制anti-BrdU一抗工作液：將anti-BrdU(mouse mAb)用封閉液（3% BSA）稀釋100倍，配制成anti-BrdU一抗工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，4℃保存；

4. 二抗工作液：根據(jù)檢測需要自備HRP標記（后續(xù)經(jīng)白光檢測，配套DAB顯色試劑盒，抗小鼠二抗，并用PBS稀釋配制成二抗工作液。

操作步驟

細胞樣品：

1. 細胞準備：提前準備細胞爬片，確保細胞狀態(tài)正常，貼壁良好；

2. BrdU孵育：細胞經(jīng)含BrdU的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中避光孵育一定時間，BrdU濃度及細胞孵育時間依據(jù)細胞種類不同，建議預(yù)實驗摸索最佳條件。注意事項中已測試細胞實驗條件可供參考；

3. 細胞固定：上述經(jīng)BrdU孵育的細胞爬片，PBS洗3次，每次5 min。向孔板內(nèi)加入1 mL 4%多聚甲醛覆蓋細胞，室溫固定20-30 min。PBS洗3次，每次5 min；

4. 通透：向孔板內(nèi)滴加破膜液覆蓋細胞處理8-10 min，PBS洗3次，每次5 min；

5. 細胞核染色（可選）：

若后續(xù)白光檢測，則用蘇木素染細胞核：向孔板內(nèi)滴加蘇木素染液室溫染色5 min，吸棄蘇木素染液，PBS洗3次，每次5 min；

若后續(xù)熒光檢測，則用DAPI染細胞核：向孔板內(nèi)滴加DAPI染液室溫染色5 min，吸棄DAPI染液，PBS洗3次，每次5 min；

6. 再固定：向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

7. 酸化：向孔板內(nèi)滴加1 M HCl覆蓋細胞，37℃處理10 min，PBS洗3次，每次5 min；

8. 后固定：再次向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

9. 封閉：向孔板內(nèi)滴加封閉液（3% BSA）室溫孵育30 min。吸棄封閉液，不要清洗；

10. Anti-BrdU抗體孵育：向孔板內(nèi)滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋細胞，4℃孵育過夜。吸棄anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；

11. 二抗孵育：向孔板內(nèi)滴加二抗工作液覆蓋細胞，室溫孵育1 h。吸棄二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標記的二抗，孵育及洗滌時均需避光；

12. 封片及鏡檢：

若是HRP標記的二抗，則用DAB顯色試劑對細胞樣品進行顯色，脫水，透明，用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在潔凈的載玻片上封片，顯微鏡觀察；

若是熒光標記的二抗，在潔凈載玻片上滴加抗熒光淬滅封片劑，用尖頭鑷子輕輕將爬片挑起，倒扣在載玻片上封片，熒光顯微鏡觀察；

組織切片樣品：

1. 動物準備：需提前準備實驗動物，并進行體內(nèi)BrdU標記，。體內(nèi)標記后根據(jù)實驗需要進行取材、固定及制備石蠟切片；

2. 組織石蠟切片脫蠟復(fù)水；

3. 修復(fù)：組畫筆畫圈圈住組織，將切片浸沒在抗原修復(fù)液中，微波加熱修復(fù)。自然冷卻；

4. 細胞核染色（可選）：

若后續(xù)白光檢測，則用蘇木素染細胞核：切片入蘇木素染液室溫染色5 min，PBS洗3次，每次5 min；

若后續(xù)熒光檢測，則用DAPI染細胞核：向組織上滴加DAPI染液室溫染色5 min，傾去DAPI染液，切片經(jīng)PBS洗3次，每次5 min；

5. 再固定：向組織上滴加4%多聚甲醛室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

6. 酸化：向切片上滴加1 M HCl覆蓋組織，37℃處理10 min，PBS洗3次，每次5 min；

7. 后固定：再次向切片上滴加4%多聚甲醛覆蓋組織室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；

8. 內(nèi)源性過氧化物酶淬滅（可選）：向切片上滴加3% H₂O₂室溫孵育25-30min，去除內(nèi)源性過氧化物酶。隨后切片經(jīng)PBS洗3次，每次5 min；

9. 封閉：向切片上滴加封閉液（3% BSA）覆蓋組織，室溫孵育30 min。去除封閉液，不要清洗；

10. Anti-BrdU抗體孵育：向切片上滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋組織，4℃孵育過夜。去除anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5 min；

11. 二抗孵育：向切片上滴加二抗工作液覆蓋組織，室溫孵育1 h。去除二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標記的二抗，孵育及洗滌時均需避光；

12. 封片及鏡檢：

若是HRP標記的二抗，則用DAB顯色試劑對組織切片進行顯色，脫水，透明，封片后顯微鏡觀察；

若是熒光標記的二抗，則滴加抗熒光淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡觀察。

結(jié)果觀察

如果用HRP標記的二抗檢測，細胞核呈深藍色，增殖細胞呈棕色。如果是熒光標記的二抗，細胞核呈藍色熒光（Ex=358 nm，Em=461 nm），增殖細胞為對應(yīng)二抗的熒光。

注意事項

1. 對于細胞爬片樣品，BrdU的使用濃度和處理時間與細胞種類有關(guān)。一般來說，處理腫瘤細胞所需濃度和時間都較低，成纖維細胞或上皮細胞等增殖較慢的細胞需要提高濃度并延長作用時間，建議濃度范圍為20-100 μM，作用時間為40 min-4 h，可根據(jù)具體細胞的種類進行摸索調(diào)整。

下表為測試的常用細胞處理濃度及時間，僅供參考。

細胞	BrdU濃度（μM）	孵育時間（min）
A549	40	40
Hela	40	40
NRK-52e	40	40
SKOV3	80	120
H9C2	40	40

2. 為保證最佳實驗效果，推薦使用本公司生產(chǎn)的其他配套試劑：蘇木素染液(G1004)；DAPI染液(G1012)；DAB顯色試劑盒(G1212），抗熒光淬滅封片劑(G1401)；

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

產(chǎn)品僅供科研用途，不用于臨床診斷！

凡合肥萬物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴格的質(zhì)量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問，請于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當?shù)剞k事處提出，并請保證該產(chǎn)品，以備本公司進行核對檢驗。如果發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問題，請于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量，以便本公司回收產(chǎn)品進行質(zhì)檢，確認產(chǎn)品質(zhì)量。如逾期，則視為已經(jīng)對本公司產(chǎn)品進行驗收。聲明：如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜，本公司僅在產(chǎn)品價格范圍內(nèi)酌情賠償，恕不接受超出產(chǎn)品價格范圍之賠償。客戶在使用過程中有任何技術(shù)問題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話我們隨時給予解答。

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