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您現(xiàn)在所在位置:主頁 > 產(chǎn)品中心 > 細(xì)胞生物學(xué) 試劑|耗材 >>細(xì)胞檢測(cè) >> Click-iT EdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
通過分析細(xì)胞增殖能力來判斷某些基因、藥物等對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞影響,或者分析不同狀態(tài)或刺激干預(yù)下生物個(gè)體組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和更新能力,是生命學(xué)科中一種常見且重要的評(píng)估手段。目前檢測(cè)細(xì)胞增殖的方法有很多,大部分是利用細(xì)胞產(chǎn)生的一些代謝酶類,來間接評(píng)定細(xì)胞的增殖活性(如CCK-8法、MTT法等),但是一些藥物或細(xì)胞本身狀態(tài)等因素都會(huì)對(duì)評(píng)定的結(jié)果造成一定影響。直接檢測(cè)細(xì)胞中DNA合成,來判斷細(xì)胞的增殖是公認(rèn)的最精確且有效的檢測(cè)方法。但是不論是最初使用的放射性標(biāo)記核苷摻入法,還是后續(xù)改進(jìn)的基于抗體檢測(cè)的BrdU法,都有著一定的自身局限性。
EdU(5-Ethynyl-2'- deoxyuridine,5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶核苷)是一種含有一個(gè)乙炔基團(tuán)的胸腺嘧啶脫氧核苷類似物,當(dāng)將其注射到動(dòng)物體內(nèi)或者對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行孵育,這些小分子能夠迅速擴(kuò)散到各個(gè)器官組織,并滲入到細(xì)胞中,可以在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸苷(T)摻入到新合成的DNA中。EdU分子中的乙炔基團(tuán)能與熒光標(biāo)記的疊氮化合物探針在銅離子催化下發(fā)生“點(diǎn)擊”反應(yīng)形成穩(wěn)定的三唑環(huán),因此可以使新合成的DNA被相應(yīng)的熒光探針?biāo)鶚?biāo)記。EdU檢測(cè)法同放射性標(biāo)記核苷摻入法相比,沒有放射性污染等限制因素;同BrdU檢測(cè)法相比,EdU檢測(cè)法不需要DNA的變性處理,也不用抗原抗體反應(yīng),這大大減少了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和時(shí)間,也使其變得更省時(shí)、更靈敏、更穩(wěn)定和更準(zhǔn)確。本試劑盒可用于檢測(cè)體外培養(yǎng)的細(xì)胞或動(dòng)物組織中細(xì)胞增殖情況。本試劑盒中熒光探針為綠色熒光,最大激發(fā)波長(zhǎng)為491 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為516 nm,處于增殖的細(xì)胞被標(biāo)記后,細(xì)胞核會(huì)顯示出明亮的綠色熒光,通過配套常規(guī)細(xì)胞核染料共同標(biāo)記細(xì)胞核(本試劑盒提供Hoechst 33342細(xì)胞核染料),可用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等儀器直接觀察細(xì)胞增殖情況;也可以使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外培養(yǎng)細(xì)胞群熒光強(qiáng)度,根據(jù)熒光強(qiáng)度,來判斷細(xì)胞周期中S期的DNA復(fù)制活性。
儲(chǔ)存與運(yùn)輸
冰袋(wet ice)運(yùn)輸;-20℃避光保存,EdU催化試劑(試劑A)、反應(yīng)緩沖液可4℃保存;有效期12個(gè)月。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. 含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基;
2. 通透液:含0.2-0.5% Triton X-100 的緩沖液;
3. 固定液:4%多聚甲醛或其他類似用途的試劑;
4. PBS緩沖液;
5. 超純水;
6. 動(dòng)物造模以及組織切片相關(guān)試劑(動(dòng)物組織細(xì)胞增殖檢測(cè))。
操作步驟
1. 體外細(xì)胞樣品以及試劑準(zhǔn)備工作:
1.1. 將細(xì)胞按一定密度均勻種植于細(xì)胞培養(yǎng)板中(種植密度,由細(xì)胞大小、生長(zhǎng)快慢等因素決定),待細(xì)胞貼壁或恢復(fù)正常狀態(tài)后,進(jìn)行相應(yīng)的藥物刺激等處理(如檢測(cè)懸浮細(xì)胞,請(qǐng)按懸浮細(xì)胞常規(guī)操作方式進(jìn)行,整體實(shí)驗(yàn)均需添加離心等步驟)。
1.2. 催化添加劑(試劑C)低速離心,加入1 mL超純水溶解,并分裝后于-20℃存放備用。
2. 體外細(xì)胞EdU標(biāo)記、固定及通透:
2.1. 配制2×EdU孵育工作液:每1 mL完全細(xì)胞培養(yǎng)基中加入2 μL EdU存儲(chǔ)液(10 mM),即為20 μM的2×EdU孵育工作液,并放入培養(yǎng)箱中預(yù)熱(建議預(yù)實(shí)驗(yàn)以EdU工作濃度為10 μM進(jìn)行摸索);
2.2. 以半換液的模式,將培養(yǎng)板中原細(xì)胞培養(yǎng)基吸除一半,并補(bǔ)加等體積預(yù)熱的2×EdU孵育工作液,孵育一定的時(shí)間(孵育的時(shí)間一般取決于對(duì)應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)周期,通常占細(xì)胞周期10%左右的時(shí)間。對(duì)于大多貼壁且生長(zhǎng)較快的細(xì)胞,建議孵育2 h左右。具體情況,需要隨細(xì)胞特性、處理后實(shí)際情況等進(jìn)行調(diào)整。如需孵育較長(zhǎng)時(shí)間可適當(dāng)降低EdU工作濃度;較短時(shí)間則可適當(dāng)提高EdU濃度);
2.3. 將EdU標(biāo)記孵育后的細(xì)胞樣品,用PBS緩沖液清洗1-2次后,加入固定液,覆蓋細(xì)胞即可,室溫固定15 min(如需用流式檢測(cè),貼壁細(xì)胞此步之前先消化重懸后再固定,后續(xù)按懸浮細(xì)胞的處理方式即可);用PBS緩沖液洗滌2-3次,每次3-5 min;
2.4. 去除PBS緩沖液,加入通透液,覆蓋細(xì)胞或組織即可,室溫孵育15 min;
2.5. 去除通透液后使用PBS緩沖液洗滌1-2次,每次3-5 min,然后轉(zhuǎn)至步驟4。
3. 動(dòng)物EdU注射造模以及組織切片處理:
3.1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,以腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、尾靜脈注射等方式對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一次或多次EdU注射造模,一般實(shí)驗(yàn)EdU用量和動(dòng)物體重的比值為5 mg/kg,具體注射量根據(jù)研究?jī)?nèi)容和動(dòng)物情況而定。本試劑盒中提供部分EdU儲(chǔ)存液,主要用于體外細(xì)胞EdU標(biāo)記,如需對(duì)動(dòng)物進(jìn)行EdU造模,可單獨(dú)訂購EdU試劑(推薦G5059);
3.2. 小腸等上皮組織細(xì)胞增殖速度快,大腦等組織細(xì)胞增殖速度慢,生長(zhǎng)較快的組織部位通常標(biāo)記時(shí)間小于12小時(shí),而生長(zhǎng)較慢的組織標(biāo)記時(shí)間可能需幾天;最佳標(biāo)記時(shí)間根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)而定,由于小腸上皮組織增殖較快,建議取該類組織作為標(biāo)記參考;
3.3. 將造模動(dòng)物按照規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)處死后,取出所需的組織,按照常規(guī)步驟制作冰凍切片或石蠟切片;
a. 對(duì)于冰凍切片:放置恢復(fù)到室溫,加入適量固定液,室溫固定15 min。去除固定液,用適量PBS緩沖液洗滌3次,每次3-5 min;去除PBS緩沖液,用適量通透液覆蓋組織室溫孵育10-15 min;去除通透液,用PBS緩沖液洗滌1-2次,每次3-5 min,然后轉(zhuǎn)至步驟4。
b. 對(duì)于石蠟切片:切片脫蠟復(fù)水,PBS洗滌5 min。去除PBS緩沖液,加入通透液,覆蓋細(xì)胞或組織即可,室溫孵育15 min;去除通透液后使用PBS緩沖液洗滌1-2次,每次3-5 min,然后轉(zhuǎn)至步驟4。
4. EdU點(diǎn)擊反應(yīng):
4.1. 在細(xì)胞或組織固定和穿孔期間,配制點(diǎn)擊反應(yīng)液(對(duì)于不同樣本配制體系參考以下表中方案)
對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞:本參考步驟是對(duì)應(yīng)10個(gè)96孔板樣品的體積用量(每孔100 μL),可根據(jù)使用需求,等比例增加或減少配制量,請(qǐng)按下表順序依次添加組分,邊加邊混勻(現(xiàn)配現(xiàn)用);
Component |
Volume |
反應(yīng)緩沖液 |
935 μL |
催化試劑(試劑A) |
10 μL |
熒光染料iF488(試劑B) |
5 μL |
催化添加劑(試劑C) |
50 μL |
總體積 |
1000 μL |
對(duì)于組織細(xì)胞切片:參考下體系進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)液體系的配制,可根據(jù)切樣本數(shù),等比例增加或減小配制量,每個(gè)切片樣本約用100-200 μL的點(diǎn)擊反應(yīng)液覆蓋。
Component |
Volume |
反應(yīng)緩沖液 |
928 μL |
催化試劑(試劑A) |
10 μL |
熒光染料iF488(試劑B) |
12 μL |
催化添加劑(試劑C) |
50 μL |
總體積 |
1000 μL |
4.2. 去除上一步(步驟2.5或3.3)PBS緩沖液,加入點(diǎn)擊反應(yīng)液,輕搖保證反應(yīng)液全部覆蓋細(xì)胞或組織,室溫避光孵育30 min;
4.3. 去除點(diǎn)擊反應(yīng)液,PBS緩沖液洗滌2-3次,每次3-5 min(如無其他特別要求,即可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度或用其他儀器檢測(cè)熒光效果)。
5. 細(xì)胞核染色:
5.1. 去除上一步PBS緩沖液,將Hoechst 33342染色液與PBS緩沖液以1比500-1000比例稀釋后,加入覆蓋細(xì)胞,孵育5 min;
5.2. 去除Hoechst 33342染色液,PBS緩沖液洗滌2-3次,每次3-5 min。
6. 成像以及檢測(cè)分析
直接將體外培養(yǎng)的細(xì)胞或者組織切片樣品置于熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等儀器檢測(cè),分析處于增殖的細(xì)胞占比;或者收集體外培養(yǎng)的細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(建議使用未經(jīng)EdU標(biāo)記的細(xì)胞樣品作為流式細(xì)胞儀檢測(cè)的陰性對(duì)照,并選擇合適的電壓),根據(jù)熒光強(qiáng)度,來判斷細(xì)胞周期中S期的DNA復(fù)制活性。本試劑盒熒光染料iF488(試劑B)對(duì)應(yīng)的光譜特性為Ex/Em:491 nm/516 nm(綠色);Hoechst 33342染色液對(duì)應(yīng)的光譜特性為Ex/Em:346 nm/460 nm(藍(lán)色)。
注意事項(xiàng)
1. 對(duì)于體外培養(yǎng)細(xì)胞,具體EdU使用濃度、孵育時(shí)間隨樣品以及研究目的的不同,可進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。
2. 部分組織細(xì)胞增殖速度緩慢,為了排除造模效果不佳等因素,建議選增殖快的組織樣品作為參照樣本(如腸道組織)。
3. 如果背景顏色過深,可能是實(shí)驗(yàn)中洗滌不充分、組織樣品固定時(shí)間過長(zhǎng)、固定液殘余導(dǎo)致。
4. EdU催化添加試劑(試劑C)易氧化,盡量避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中,配制成水溶液后,建議分裝保存;經(jīng)測(cè)試,如EdU催化添加試劑顏色發(fā)生輕微變化,點(diǎn)擊反應(yīng)催化體系依舊能夠正常進(jìn)行,如呈現(xiàn)棕色,表明該組分已失效,請(qǐng)棄用。
5. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服,佩戴一次性手套。
本產(chǎn)品僅供科研用途,不用于臨床診斷!
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