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產(chǎn)品詳情
操作說(shuō)明
注意事項(xiàng)
產(chǎn)品簡(jiǎn)介
細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，主要分為細(xì)胞分裂間期與有絲分裂期（M期）兩個(gè)階段；細(xì)胞間期主要由DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成后期（G2期）組成，整個(gè)細(xì)胞周期變化順序可用G1→S→G2→M來(lái)表示。首先G1時(shí)期：細(xì)胞主要合成RNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)，為細(xì)胞進(jìn)入S期做好物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備；隨后進(jìn)入S期：細(xì)胞開始進(jìn)行DNA和一些組蛋白等物質(zhì)合成，細(xì)胞DNA含量開始增加；最后到G2期：這時(shí)細(xì)胞DNA含量已經(jīng)變成了G1時(shí)期的2倍，并已經(jīng)停止了DNA的復(fù)制，為進(jìn)入有絲分裂期做大量的蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成；如果G0（細(xì)胞暫時(shí)停止分裂和分化期、靜止期）/G1期，細(xì)胞中DNA含量為1N；那么處于G2期的細(xì)胞中DNA含量為2N；而處于G1和G2時(shí)期之間的S期細(xì)胞，DNA含量在1N~2N之間；而凋亡的細(xì)胞，細(xì)胞核會(huì)發(fā)生濃縮和DNA片段化，導(dǎo)致部分基因組DNA片段丟失，所以其DNA含量是小于1N的，在流式檢測(cè)的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰，即凋亡細(xì)胞峰。因此，可根據(jù)細(xì)胞DNA的含量來(lái)判斷細(xì)胞所處的周期和狀態(tài)。
細(xì)胞凋亡也可以用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞光散射的變化來(lái)檢測(cè)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮、核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體，使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。凋亡前期，染色質(zhì)皺縮，細(xì)胞密度增加，前向角光散射色顯著降低；凋亡后期，細(xì)胞產(chǎn)生凋亡小體，前向角光散射和側(cè)向角光散色均顯著降低。
細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒（Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit）采用了經(jīng)典的碘化丙啶染色(Propidium staining)方法對(duì)細(xì)胞周期與凋亡進(jìn)行檢測(cè)分析。利用碘化丙啶能夠嵌入雙鏈DNA中，并使其產(chǎn)生熒光，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比的特性；結(jié)合細(xì)胞不同周期中，DNA含量的規(guī)則變化，可以區(qū)分細(xì)胞處于的周期和狀態(tài)。本試劑盒可用于組織細(xì)胞、貼壁或懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)（如用于組織的細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)，則須把組織消化成單細(xì)胞狀態(tài)，才可進(jìn)行檢測(cè)）。
儲(chǔ)存與運(yùn)輸
冰袋(wet ice)運(yùn)輸；-20℃避光保存，染色緩沖液可4℃保存；12個(gè)月有效。
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. 含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基；
2. 胰蛋白酶消化液；
3. PBS緩沖液；
4. 75%乙醇。
操作步驟
1. 細(xì)胞樣品準(zhǔn)備（細(xì)胞數(shù)量控制在1×105~1 ×106個(gè)）
1.1. 對(duì)于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓松動(dòng)，加入適量含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹散細(xì)胞，將細(xì)胞制成懸液；將懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 g離心3-5 min，棄上清，保留細(xì)胞沉淀；再用預(yù)冷PBS緩沖液潤(rùn)洗1-2次細(xì)胞沉淀，同樣方法離心棄上清，保留細(xì)胞沉淀。
1.2. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：直接將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 g離心3-5 min，棄上清，保留細(xì)胞沉淀；再用預(yù)冷PBS緩沖液潤(rùn)洗1-2次細(xì)胞沉淀，同樣方法離心棄上清，保留細(xì)胞沉淀。
1.3. 對(duì)于組織細(xì)胞：將組織盡量剪切成小塊，根據(jù)組織來(lái)源，選擇胰酶、膠原酶等消化酶消化組織塊，并用100-300目篩網(wǎng)過濾，得到單細(xì)胞懸液；將過濾后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)到離心管中，1000 g離心3-5 min，棄上清，保留細(xì)胞沉淀；再用預(yù)冷PBS緩沖液潤(rùn)洗1-2次細(xì)胞沉淀，同樣方法離心棄上清，保留細(xì)胞沉淀。
2. 細(xì)胞樣品固定
2.1. 向收集的細(xì)胞沉淀樣品中加入1 mL冰上預(yù)冷的75%乙醇，輕輕吹打細(xì)胞，使其充分接觸；
2.2. 將細(xì)胞置于4℃固定30 min或更長(zhǎng)時(shí)間（通常固定2 h或以上更能保證染色效果，固定12-24 h可能效果更佳，可提高染色效果）。
2.3. 固定一定時(shí)間后，將細(xì)胞1000 g離心3-5 min，去除乙醇固定液，保留細(xì)胞沉淀；
2.4. 輕敲離心管底部，使細(xì)胞分散，用PBS緩沖液重懸并洗滌細(xì)胞，1000 g離心3-5 min，棄上清收集細(xì)胞沉淀；
3. 染色工作液的配制與染色
3.1. 根據(jù)下表避光配制染色工作液，配制量可以根據(jù)使用需求，等比例增加或減少（配制完成的染色工作液短時(shí)間內(nèi)可以4℃保存，請(qǐng)當(dāng)日內(nèi)使用）；
|
|
1個(gè)樣品 |
5個(gè)樣品 |
10個(gè)樣品 |
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染色緩沖液 |
480 μL |
2.4 mL |
4.8 mL |
|
PI染色液（50×） |
10 μL |
50 μL |
100 μL |
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RNaseA試劑（50×） |
10 μL |
50 μL |
100 μL |
|
總體積 |
500 μL |
2.5 mL |
5 mL |
3.2. 輕敲離心管底部，使步驟2.4中沉淀的細(xì)胞分散，再加入500 μL配制好的染色工作液，輕輕吹打，使細(xì)胞分散并與染色工作液混勻；
3.3. 37℃避光孵育30 min，即可用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
4. 流式檢測(cè)和分析
用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488nm波長(zhǎng)處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。
注意事項(xiàng)
1. 熒光染料均存在熒光淬滅問題，使用和保存過程中盡量避光；
2. 在實(shí)驗(yàn)前建議對(duì)細(xì)胞進(jìn)行周期同步化處理，避免細(xì)胞所處周期不同導(dǎo)致的較大重復(fù)性差異；
3. 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞種植密度不宜過高也不宜過低，以防出現(xiàn)接觸抑制或密度依賴等現(xiàn)象；4. 操作PI染色液時(shí)應(yīng)注意防護(hù)，避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)；
5. 操作時(shí)請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴一次性手套。
產(chǎn)品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
凡合肥萬(wàn)物生物科技有限公司銷售的產(chǎn)品均有嚴(yán)格的質(zhì)量保證。如發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品存在包裝規(guī)格疑問，請(qǐng)于收貨之日起七日內(nèi)向我公司總部或當(dāng)?shù)剞k事處提出，并請(qǐng)保證該產(chǎn)品，以備本公司進(jìn)行核對(duì)檢驗(yàn)。如果發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量問題，請(qǐng)于收貨后一月內(nèi)保留產(chǎn)品50%以上的量，以便本公司回收產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)檢，確認(rèn)產(chǎn)品質(zhì)量。如逾期，則視為已經(jīng)對(duì)本公司產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)收。 聲明：如發(fā)生產(chǎn)品索賠事宜，本公司僅在產(chǎn)品價(jià)格范圍內(nèi)酌情賠償，恕不接受超出產(chǎn)品價(jià)格范圍之賠償。客戶在使用過程中有任何技術(shù)問題可以撥打技術(shù)售后服務(wù)電話我們隨時(shí)給予解答。
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